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In quest’ambito le ricerche effettuate sono state concentrate su sistemi di neuropeptidi coinvolti in varie funzioni. In particolare, hanno riguardato il fattore di rilascio delle gonadotropine ipofisarie (GnRH) la famiglia dei peptidi FMRFammide, i peptidi derivati dalla proopiomelanocortina (POMC), il neuropeptide Y (NPY) e la somatostatina. L'obiettivo principale di queste ricerche è stato indirizzato verso lo studio dell'evoluzione e lo sviluppo del cervello, utilizzando come modelli i sistemi di neuropeptidi, con lo scopo di tentare di capire il significato zoologico delle strutture neuronali in funzione degli adattamenti neuroanatomici e funzionali osservati.

GnRH

Il fattore di rilascio per le gonadotropine ipofisarie (gonadotropin releasing hormone: GnRH), è un decapeptide presente, in varie forme molecolari, nel sistema nervoso centrale e periferico dei vertebrati ed è stato rilevato anche in alcuni gruppi d'invertebrati. Il suo ruolo, storicamente riconosciuto, è quello di stimolare la secrezione delle gonadotropine ipofisarie nei vertebrati.

Le ricerche su questo neuropeptide sono state condotte in diverse specie di vertebrati e in un urocordato (Ciona intestinalis), per avere indicazioni circa:

1.  La variabilità strutturale della molecola e la sua evoluzione.

2.  L’organizzazione del sistema GnRH immunoreattivo (ir) nell’encefalo.

3.  L’origine ontogenetica delle diverse popolazioni di neuroni secernenti varianti molecolari del GnRH.

4.  Gli effetti ambientali sul sistema GnRH, della manipolazione chirurgica di strutture funzionalmente connesse al sistema e delle somministrazioni ormonali.

Con il termine GnRH, nella discussione che segue, s’intenderà, se non altrimenti specificato, una forma generica non determinata del decapeptide.

1. L’approccio metodologico multivariato si è avvalso delle seguenti tecniche: IHC, RIA, HPLC e determinazione della sequenza. Così è stato possibile rilevare due forme molecolari di GnRH: mammalian (mGnRH) e chicken-II (cGnRH-II), nella maggioranza delle specie di vertebrati studiate e di altre forme (chicken I e salmon GnRHs) presenti con minore frequenza. Un interessante risultato è stato ottenuto in C. intestinalis, in cui è stata accertata per la prima volta la presenza dell’mGnRH e del cGnRH-I nelle gonadi di un non vertebrato. Questo dato ha chiaramente dimostrato che la struttura molecolare di questi peptidi è conservata durante l’evoluzione dei cordati, così come probabilmente anche il loro coinvolgimento funzionale nella fisiologia della riproduzione.

2. La distribuzione neuroanatomica delle forme molecolari del GnRH è stata studiata in 3 specie di anfibi anuri (Rana esculenta, Xenopus laevis, Pachymedusa dacnicolor), 4 urodeli (Triturus carnifex, Triturus vulgaris, Salamandra salamandra, Ambystoma mexicanum e 2 apodi (Typhlonectes compressicauda, Ichthyophis beddomei). Ciò che emerso da queste ricerche è che negli anfibi il sistema GnRH risponde generalmente ad uno schema base comune. In particolare, è presente un sistema GnRH anteriore compreso nell’area preottica e nell’area mediana del setto con l’estensione al NT, costituito da neuroni secernenti mGnRH e un sistema posteriore i cui neuroni sono localizzati nel tegmento mesencefalico e producono cGnRH-II.

Variazioni a questo pattern sono state rilevate in T. carnifex e S. salamandra nei quali non è presente il nucleo cGnRH-II ir tegmentale. Questa apparente anomalia è stata associata alla scarsa sensibilità degli anticorpi per la forma di GnRH mesencefalica e al basso contenuto del peptide nel mesencefalo di queste specie.

Per contro, in altre specie, oltre ai sistemi anteriore e posteriore, sono evidenti popolazioni aggiuntive di neuroni GnRH ir. Infatti, in R. esculenta ci sono due popolazioni GnRH ir nel talamo e nell’infundibolo; in T. vulgaris sono presenti due gruppi mesencefalici di neuroni cGnRH-II ir: oltre a quello tegmentale, c’è anche un nucleo nell’organo paraventricolare; in X. laevis sono stati rilevati neuroni mGnRH ir anche nelle abenule e nella commessura abenulare; in A. mexicanum i neuroni cGnRH II sono apparsi anche nel rombencefalo.

Al fine di approfondire le conoscenze relative alle modificazioni evolutive del sistema GnRH ir è stata studiata la lucertola (Podarcis sicula), come modello sperimentale fra i rettili. In questa specie sono presenti due popolazioni separate di neuroni GnRH ir, localizzate nell’infundibolo dorsale e nel tegmento mesencefalico. Questi neuroni sono stati evidenziati inizialmente con tutti gli antisieri disponibili (anti mGnRH, sGnRH, cGnRH I e II) contro le diverse varianti molecolari del peptide. In conseguenza di ciò e sulla base della scarsa reattività in RIA, tra gli antisieri e le forme varianti di GnRH fornite dai produttori, è stata proposta la presenza contemporanea delle varie forme nelle stesse cellule. Successivamente, sono stati eseguiti controlli di reattività crociata tra gli antisieri in IHC e mediante test di preassorbimento omologo e eterologo. Queste prove hanno mostrato spesso una reattività crociata piuttosto spinta, ponendo seri dubbi sulla presenza contemporanea delle varianti molecolari del GnRH negli stessi neuroni.

Comunque, sotto il profilo neuroanatomico, la lucertola adulta, diversamente dagli anfibi studiati, manca del sistema anteriore. Questa organizzazione è anche confermata da risultati sulla distribuzione del GnRH ottenuti nella luscengola.

3. L’ontogenesi del sistema GnRH ir è stata studiata negli anfibi T. carnifex, R. esculenta e P. dacnicolor e nel rettile P. s. sicula.

Negli stadi larvali precoci del tritone crestato (T. carnifex) i neuroni GnRH ir appaiono esclusivamente nelle branche del NT dell’area nasale. L’analisi degli stadi successivi dello sviluppo ha rivelato che questi neuroni erano presenti anche in componenti più prossimali del nervo e nell’area preottica. Inoltre, al procedere dello sviluppo, i neuroni GnRH ir erano sempre più presenti nell’encefalo, mentre diminuivano progressivamente nel NT. Questi dati hanno sostenuto l’ipotesi che i neuroni GnRH nel tritone, in analogia con quanto avviene nei mammiferi, originano dal placode olfattivo e migrano nel cervello attraverso il NT.

L’ipotesi dell’origine placodale del sistema GnRH ir è stata confermata anche in R. esculenta e P. dacnicolor. In questi casi è stato anche accertato che sono i neuroni mGnRH del sistema anteriore che hanno un’origine placodale. Per contro, i neuroni cGnRH-II del sistema posteriore, non rilevati nel tritone, ma apparsi più precocemente di quelli mGnRH in questi anuri nel mesencefalo, hanno probabilmente un'origine locale, dal neuroepitelio del III ventricolo.

Mentre la derivazione ependimale dei neuroni cGnRH-II è stata confermata studiando l’ontogenesi della lucertola, l’origine placodale in questa specie non è evidente. Tuttavia è da rilevare la presenza transitoria di neuroni GnRH ir a livello del telencefalo centrale, lungo le vie seguite dal NT, quindi anche in questo rettile potrebbe avvenire una sorta di migrazione di neuroni GnRH ir dal placode olfattivo lungo il NT. Questo dato potrebbe indicare che il sistema anteriore GnRH possa essere solo transitoriamente espresso nella lucertola.

Gli studi sull’ontogenesi sono stati affrontati anche mediante radioimmunodosaggi delle diverse forme molecolari del GnRH. In questo modo sono state dosate le quantità di mGnRH e cGnRH-II nell'encefalo e nell'ipofisi della rana (R. esculenta) durante lo sviluppo. I risultati hanno indicato anche in questo caso che entrambe le forme di GnRH sono presenti nell'encefalo in stadi larvali precoci. Un dato interessante è che l'mGnRH è presente sempre in quantità maggiori rispetto al cGnRH-II, sia nell'encefalo che nell'ipofisi. Inoltre, nella capsula nasale è presente solo la forma mGnRH, confermando l’origine separata delle popolazioni di neuroni GnRH secernenti.

4. Nella rana (R. esculenta) adulta il contenuto encefalico delle forme mGnRH e cGnRH-II varia in relazione al ciclo riproduttivo annuale; infatti, la loro concentrazione è più alta nel periodo preriproduttivo e raggiunge i valori più bassi verso la fine della stagione riproduttiva. Queste modificazioni stagionali sono correlate a quelle dei livelli plasmatici degli steroidi sessuali, a conferma dell'ipotesi della regolazione steroidea del sistema neuronale GnRH. Parallelamente, nella stessa specie, è stato anche evidenziato, mediante IHC che la castrazione provoca una diminuzione dei neuroni mGnRH nell’area preottica e che la terapia di sostituzione steroidea ne ristabilisce il numero normale. Un’ulteriore conferma della regolazione steroidea del sistema GnRH negli anfibi deriva da uno studio prodotto sempre in R. esculenta, ma durante lo sviluppo. In questo caso è stata osservata una stretta correlazione tra le varie tappe della spermatogenesi e il differenziamento del sistema GnRH.

 

FMRFammide

Questo tetrapeptide, isolato da un ganglio di un mollusco, è presente, in forme varianti, nel sistema nervoso dei vertebrati. Queste forme possono essere evidenziate con antisieri prodotti contro la parte c-terminale ammidata, conservata in tutti i peptidi appartenenti alla famiglia degli FMRFammidi. Si suppone che questi peptidi svolgano funzioni neuromodulatorie, neurotrasmettitorie e neurormonali.

La distribuzione neuroanatomica del materiale FMRFammide ir è stata studiata mediante IHC in 5 specie di pesci (Danio rerio, Acipenser ruthenus, Neoceratodus forsteri, Dicentrarcus labrax e Carassius auratus in 8 anfibi anuri (R. esculenta, Bufo bufo, P. dacnicolor, Ceratophrys ornata, Eleutherodactylus coqui, X. laevis, Pipa pipa, Hyla crucifer), in 3 urodeli T. vulgaris, T. carnifex e A. tigrinum, in 2 apodi (I. beddomei e T. compressicauda, in 2 rettili squamati (P. s. sicula, Chalcides chalcides), nel loricato Caiman crocodilus e nel chelone Trachemys scripta elegans). Molti di questi studi sono stati concentrati sugli aspetti ontogenetici.

I dati ottenuti hanno dato utili indicazioni circa:

1.  Le potenziali funzioni dei peptidi FMRFammide simili.

2.  La variabilità del sistema FMRFammide ir nell’encefalo delle specie studiate.

3.  L’origine ontogenetica dei neuroni FMRFammide ir.

Nella trattazione che segue per FMRFammide dovrà intendersi una forma indeterminata dei neuropeptidi FMRFammide simili.

1. Una dato interessante emerso da queste ricerche è stato la colocalizzazione del GnRH e del FMRFammide in alcuni neuroni nell'area preottica anteriore e la presenza di fibre nell'eminenza mediana della rana adulta (R. esculenta). Inoltre, sono anche stati osservati neuroni GnRH direttamente innervati da fibre FMRFammide ir. Questi risultati sostengono l’ipotesi del coinvolgimento di questi peptidi nella modulazione della rete GnRH e, quindi, nel controllo della riproduzione.

2. Il sistema FMRFammide nei pesci adulti studiati è apparso meno esteso rispetto a quello riportato in letteratura. In particolare, i neuroni FMRFammide ir  si sono resi evidenti nel nucleo periventricolare ipotalamico di tutte le specie. Un altro nucleo FMRFammide ir è il cosiddetto nucleo olfattoretinale, disposto nel telencefalo anteriore basale di D. rerio, D. labrax e C. auratus, ma assente nello storione e nel dipnoo australiano.

Negli anfibi la situazione appare piuttosto diversa dai pesci. Negli anuri ci sono due popolazioni principali di neuroni FMRFammide ir, presenti in tutte le specie studiate: una nell’area septo-preottica e una nel nucleo soprachiasmatico. Frequente è anche la presenza di neuroni FMRFammide ir nell’infundibolo. Alcune particolarità sono emerse in X. laevis e P. dacnicolor, in cui tali neuroni sono stati osservati anche nel chiasma ottico e in P. pipa con neuroni aggiuntivi nel tegmento mesencefalico. Un’altra localizzazione atipica è osservabile in T. compressicauda in cui vi sono neuroni FMRFammide ir talamici. Complessivamente la maggiore differenza tra gli anfibi è la presenza di questi neuroni nell’area mediana del setto degli anuri e la loro assenza in apodi e urodeli.

Nei rettili il sistema FMRFammide ir appare più articolato rispetto ai taxa precedenti. Esso risponde ad uno schema base comune, con alcune varianti specifiche. In particolare, la presenza di neuroni FMRFammide ir è stata osservata in tutte le specie studiate nella banda diagonale del Broca, nel nucleo accumbens, nel nucleo settale mediale, nell’area soprachiasmatica, nel nucleo periventricolare ipotalamico e nell’area ipotalamica laterale. Interessante rilevare la presenza di neuroni FMRFammide ir nel mesencefalo unicamente in P. s. sicula, mentre nella testuggine paluste (T. s. elegans) neuroni FMRFammide ir aggiuntivi sono presenti nella corteccia laterale e nel paleostriato. Infine, il caimano (C. crocodilus) presenta come caratteristica specifica cellule FMRFammide ir nel chiasma e nei tratti ottici. Tra questi rettili l’organizzazione del sistema FMRFammide della lucertola è quello che più somiglia all’equivalente sistema dei mammiferi.

L’analisi complessiva di tutte le specie studiate mostra una tendenza verso la parcellazione del sistema FMRFammide ir; infatti, i nuclei ir incrementano numericamente dai pesci ai rettili.

I dati comparativi prodotti, uniti a quelli ottenuti studiando il sistema GnRH ir, depongono a favore di una notevole plasticità evolutiva e adattabilità intergruppo dell’encefalo.

3. Le ricerche condotte nei pesci hanno portato alla conclusione che parte del sistema FMRFammide ir deriva, in analogia con quello GnRH, dal placode olfattivo. Infatti, nel pesce zebrato (D. rerio) e nello storione (A. ruthenus), i neuroni FMRFammide ir sono presenti in stadi precocissimi dello sviluppo nel placode e poi durante lo sviluppo sono osservabili lungo il NT progressivamente più numerosi nelle componenti più prossimali del nervo. Un’analoga situazione è osservabile in R. esculenta. Nei rettili tracce di questo meccanismo migrazionale sono state ottenute nel caimano (C. crocodilus) e nella luscengola (C. chalcides). In questi casi, però, i neuroni migranti lungo il NT sono più sporadici.

Una dimostrazione della parziale origine placodale è venuta da campioni sottoposti ad operazione di placodectomia olfattiva. L’operazione è stata condotta con successo nel rospo comune (B. bufo) e nel dipnoo australiano (N. forsteri). Quest’ultimo rappresenta l’unico caso di placodectomia olfattiva in un pesce. Queste specie, sacrificate in tempi diversi dopo l’asportazione (unilaterale e bilaterale) del placode olfattivo, risultano in una totale assenza di neuroni FMRFammide ir nel telencefalo del lato operato, mentre la manipolazione chirurgica non ha alcun effetto sui neuroni diencefalici.

In definitiva, il sistema FMRFammide consiste almeno di due popolazioni di neuroni che hanno un’origine ontogenetica distinta. Un gruppo di neuroni più anteriore nell’encefalo deriverebbe dal placode olfattivo, mentre per i neuroni FMRFammide più posteriori sembra plausibile, in analogia con il GnRH, proporre un’origine neuroepiteliale locale.

 

Peptidi derivati dalla POMC

La proopiomelanocortina (POMC) è un peptide ad alto peso molecolare presente nell’encefalo dei vertebrati da cui derivano alcuni neuropeptidi biologicamente attivi, come l’ACTH, l’a- MSH e la b-END. La distribuzione di questa sostanze è stata studiata nell’encefalo e nell’ipofisi di R. esculenta durante lo sviluppo.

Nella pars intermedia dell’ipofisi l’ACTH e l’a-MSH sono stati localizzati sin dagli stadi precoci dello sviluppo, laddove la b-END era sempre assente. Per contro, i tre peptidi sono stati rilevati tutti nella pars distalis, anche se l’a-MSH era scarsamente rappresentato e presente solo in stadi precoci dello sviluppo. Tutti i peptidi hanno mostrato costantemente una colocalizzazione nelle stesse cellule ipofisarie.

Nel cervello l’a-MSH si rende evidente molto precocemente nei neuroni dell’area mediana del setto e successivamente è stato osservato anche in quelli dell’area preottica anteriore e dell’infundibolo. Gli altri due peptidi si sono stati visualizzati più tardivamente e sono apparsi simultaneamente nelle cellule dell’area mediana del setto, dell’area preottica anteriore e dell’infundibolo. Nel cervello, diversamente dall’ipofisi, non è stata osservata alcuna colocalizzazione cellulare dei peptidi. Ciò lascia presupporre che il processing della POMC possa essere differente nei due tessuti.

Un interessante risultato è stata la presenza di cellule aMSH nella mucosa nasale, permettendo di formulare l'ipotesi che anche questi peptidi, in analogia ai neuroni GnRH possono derivare, almeno in parte, dal placode olfattivo.

 

NPY

La presenza del neuropeptide Y (NPY), un membro della famiglia dei polipeptidi pancreatici, è stata dimostrata nel sistema nervoso centrale di molti vertebrati, i cui esercita diversi effetti fisiologici. Nei mammiferi esso è implicato nei meccanismi della memoria, del comportamento, nei ritmi circadiani, nel controllo della pressione sanguigna e della temperatura corporea, nella sintesi e rilascio di alcuni ormoni ipofisari e nella modulazione del sistema GnRH.

Mediante IHC è stato eseguito uno studio sull'ontogenesi delle rete neuronale NPY nell'encefalo di R. esculenta. I neuroni NPY ir compaiono immediatamente dopo la schiusa nel diencefalo. Poi rapidamente si rendono evidenti in molte aree encefaliche. Il loro numero aumenta progressivamente nel telencefalo, diencefalo, mesencefalo e rombencefalo fino al climax metamorfico, quando il  solo gruppo telencefalicodi neuroni NPY ir dell'area preottica anteriore decresce. Da sottolineare che le proiezioni delle fibre NPY ir raggiungono il lobo intermedio dell'ipofisi molto precocemente. Ciò supporta l'ipotesi che l'NPY sia coinvolto nella regolazione della pigmentazione già nei girini.

Uno studio sulla distribuzione dell’NPY è stato effettuato anche nell’apode I. beddomei. In questa specie i neuroni NPY ir sono stati osservati in tutte le suddivisioni del pallio, nell’ipotalamo, nel talamo e nel rombencefalo. Nel complesso il sistema appare molto simile a quello della rana.

 

Somatostatina

La somatostatina è un tetrapeptide ciclico noto per il suo ruolo inibitorio nel rilascio dell'ormone della crescita. Altre funzioni note sono la regolazione del rilascio della dopamina, l’induzione di fenomeni d’ipertemia e la modulazione dei riflessi spinali.

L'organizzazione del sistema somatostatinergico è stato studiato durante lo sviluppo della rana (R. esculenta). Immediatamente dopo la nascita la somatostatina è stata rilevata nei neuroni del nucleo preottico, le cui fibre raggiungono l’eminenza mediana dell’ipofisi. Questo pattern rimane inalterato nei successivi stadi dello sviluppo, ma appaiono progressivamente neuroni somatostatina ir in altre aree dell’encefalo. Il sistema nella sua espressione più completa è piuttosto complesso. Infatti, i neuroni somatostatina ir sono evidenti nell’area mediana del setto, nel pallio dorsale, laterale e mediale, nel nucleo preottico, nell’infundibolo ventrale e dorsale, nel talamo e nella sostanza grigia rombencefalica.

La presenza precoce della somatostatina nell’eminenza mediana sostiene l’ipotesi che questo peptide possa agire come fattore ipofisiotropo già durante lo sviluppo; mentre l'aumento progressivo del numero di siti encefalici in cui compaiono neuroni ir farebbe supporre che i peptidi somatostatina simili possano fungere da neuromodulatori centrali in funzione dell’incremento delle attività fisiologiche e comportamentali dal girino all’adulto.

 

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